LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PENENTUAN KADAR HAMBAT MINIMAL ANTIBIOTIK
 

 

 

Kelas B2 Dosen Pengampu :

Maharadingga , M.Si.

 

 

 

Disusun Oleh:

 

 

 

 

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF DR.HAMKA JAKARTA
2024
 

 

BAB I PENDAHULUAN

Antibiotik sebagai sebuah senyawa yang dihasilkan oleh mikroorganisme, pada konsentrasi rendah dapat memusnahkan atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain. Pengujian potensi antibiotik dilakukan untuk memberikan jaminan bahwa kualitas dan mutu antibiotik yang digunakan dalam pengobatan memenuhi persyaratan yang telah ditentukan (Radji and Manurung, 2010).

Antibiotik digunakan untuk membasmi mikroba penyebab terjadinya infeksi. Gejala infeksi terjadi akibat gangguan langsung oleh mikroba dan berbagai zat toksik yang dihasilkan mikroba. Antibiotik yang digunakan untuk membasmi mikroba penyebab penyakit pada manusia, harus memiliki sifat toksik selektif. Artinya, antibiotik harus bersifat toksik untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksik untuk hospes atau inang. Toksisitas selektif tergantung kepada struktur yang dimiliki sel bakteri dan manusia (Harmita dan Radji, 2008).

Pada umumnya, pengujian potensi antobiotik secara mikrobiologi dilakukan dengan menggunakan 2 metode, yaitu turbidimetri dan lempeng silinder atau difusi agar. Prinsip metode turbidimetri adalah berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroorganisme dalam media cair yang mengandung larutan antibiotik, sedangkan prinsip metode lempeng silinder atau difusi agar adalah membandingkan zona hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji oleh dosis senyawa antibiotik yang diuji terhadap zona hambatan oleh dosis antibiotik baku pembanding pada media lempeng agar (Jawetz et al., 2001).

Selain itu, metode difusi digunakan dalam uji sensitivetas bakteri. Metode tersebut dilakukan dengan cara mengamati daya hambat pertumbuhan mikroorganisme oleh ekstrak yang diketahui dari daerah di sekitar kertas cakram (paper disc) yang tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme. Zona hambatan pertumbuhan inilah yang menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap bahan anti bakteri (Jawetz et al., 2001).

Beberapa cara dapat digunakan untuk menguji aktivitas suatu antimikroba diantaranya dengan teknik pengenceran tabung. Teknik inidigunakan untuk menetapkan jumlah terkecil zat antimikroba yang dibutuhkan dalam menghambat pertumbuhan mikroorganisme secara in vitro. Jumlah tersebut dikenal sebagai KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) (Pelzar dan Chan, 2005). KHM adalah konsentrasi minimal zat antimikroba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri yang diketahui dengan cara mengamati banyaknya koloni bakteri yang tumbuh dengan menggunakan metode dilusi (Tortora, dkk, 2010).

 

 

1.2  Tujuan Praktikum

a.       Mahasiswa mampu melakukan uji potensi antimikroba menggunakan metode difusi secara silinder.

b.      Mahasiswa mampu melakukan uji potensi antimikroba menggunakan metode difusi secara cakram.

 

 

 

2.1 Tinjuan Pustaka

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Antibiotika adalah segolongan senyawa, baik alami maupun sintetik, yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia di dalam organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Penggunaan antibiotika khususnya berkaitan dengan pengobatan penyakit infeksi, meskipun dalam bioteknologi dan rekayasa genetika juga digunakan sebagai alat seleksi terhadap mutan atau transforman. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibiotik yang bersifat                 menghambat     pertumbuhan     mikroba,     dikenal     sebagai     aktivitas bakteriostatik, dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya masing-masing dikenal sebagai Kadar Hambat Mikroba (KHM) dan Kadar Bunuh Mikroba (KBM). Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM (Harmita dan Radji, 2008).

Staphylococcus berasal dari penampilan mikroskopiknya: sel-selnya tertanda seperti buah-buah kecil: susunan seperti ini disebabkan oleh pembelahan sel yang terjadi secra tidak teratur pada perbagai bidang. Staphylococcus bersifat anaerob fakultatif, membentuk sitokrom hanya pada kondisi aerob dan bersifat relatif tahan terhadap pengeringan. Staphylococcus Aureus bersifat patogen (oleh enzim dan eksoenzim: pembentukan nanah) mengekskresikan enterotoksin (Schlegel,1984). Stphylococcus Aureus adalah bakteri Gram positif, biasanya tersusun dalam kelompok menyerupai buah anggur yang tidak teratur. Stphylococcus Aureus tumbuh dengan mudah di berbagai medium dan aktif secara metabolik, melakukan fermentasi karbohidrat dan menghasilkan pigmen yang bervariasi dari putih hingga kuning tua. Stphylococcus Aureus bersifat koagulase positif dan merupakan pathogen utama pada manusia (Jawetz, dkk, 2005).

Daya hambatan pertumbuhan bakteri atau jamur oleh senyawa antibakteri atau jamur dapat dinyatakan berupa Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM). Nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) ditentukan menggunakan metode dilusi.

Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) dapat dilakukan dengan metode dilusi Kirby dan Bauer yang dimodifikasi menggunakan media cair Nutrien Broth (NB), TSB atau BHI (metode pengenceran serial tabung) maupun media agar selektif (metode lempeng agar) berupa MH, TSA, NA, Mac. Conkey, agar darah, dan lainnya sesuai spesies bakteri atau jamur (Lennete, dkk.,1991 dalam Fatisa, 2013). Penentuan kepekaan mikroba terhadap suatu antibiotika atau khemoterapeutik dipakai untuk menentukan pengobatan terbaik terhadap penyakit yang disebabkan oleh suatu mikroba tersebut pada manusia atau hewan. Ada dua metode untuk menentukan kadar hambat minimal suatu antibiotika yaitu :

1.  Metode Difusi

Metode yang paling sering digunakan adalah metode difusi agar dengan menggunakan cakram kertas, cakram kaca, pencetak lubang. Prinsip metode ini adalah mengukur zona hambatan pertumbuhan bakteri yang terjadi akibat difusi zat yang bersifat sebagai antibakteri didalam media padat melalui pencadang. Daerah hambatan pertumbuhan bakteri adalah daerah jernih di sekitar cakram. Luas daerah hambatan berbanding lurus dengan aktivitas antibakteri, semakin kuat daya aktivitas antibakterinya maka semakin luas daerah hambatnya. Metode ini dipengaruhi oleh banyak faktor fisik dan kimia, misalnya: pH, suhu, zat inhibitor, sifat dari media dan kemampuan difusi, ukuran molekul dan stabilitas dari bahan obat (Jawetz, dkk, 2001). Namun metode ini mempunyai kelemahan yaitu tidak dapat diketahui apakah suatu agen antimikroba sebagai bakterisidal dan bukan hanya bakteriostatik (Tortora, dkk, 2010).

2.  Metode Dilusi

Metode ini menggunakan antimikroba dengan kadar yang menurun secara bertahap, baik dengan media cair atau padat. Kemudian media diinokulasi bakteri uji dan diinkubasikan. Tahap akhir dilarutkan antimikroba dengan kadar yang menghambat atau mematikan. Metode dilusi sering digunakan untuk menentukan konsentrasi penghambat terkecil dan juga untuk menetapkan konsentrasi bakterisidal terkecil dari suatu senyawa antimikroba yang disebut kadar hambat minimum (KHM) (Tortora, dkk, 2010).

Konsentrasi hambatan minimum (KHM) adalah konsentrasi antibiotik terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan organisme tertentu. Prosedur ini digunakan untuk menentukan konsentrasi antibiotik yang masih efektif untuk mencegah pertumbuhan patogen dan mengindikasikan dosis antibiotik yang efektif untuk mengontrol infeksi pada pasien. Inokulum mikroorganisme yang telah distandarisasi ditambahkan ke dalam tabung yang mengandung seri enceran suatu antibiotika, dan pertumbuhan mikroorganisme akan termonitor dengan 25 perubahan kekeruhan. Dengan cara ini, KHM antibiotik yang dapat mencegah pertumbuhan mikroorganisme secara in vitro dapat ditentukan (Harmita dan Radji, 2008).

 

 

 

3.1  Metologi Praktikum Alat:

1.      Tabung reaksi

2.      Jarum Ose

3.      Pipet ukur

4.      Bakteri

5.      Labu ukur

Bahan:

1.      Mikroba uji standar

BAB III METOLOGI PRAKTIKUM

2.      Antibiotika uji (obat)

3.      Akuades steril

4.      Larutan dapar fosfat pH 6-8

Prosedur kerja:

1.      Sediakan biakan kuman standar dalam kaldu nutrisi atau medium NB pada agar miring suhu 37˚C selama 10 -24 jam, buat inokulasi dari suspensi kuman standar sesuai dengan reagent Mc. Farland III 0,5 atau 25% transmittan menggunakan alat spektrofotometer.

Pembuatan Inokulum

a)      Siapkan 3 tabung reaksi secara berurut dan diberi nomor 1, 2, dan 3 masing – masing diisi NaCl fisiologis/akuades steril sebanyak 9 ml.

b)      Pada tabung pertama diisi 1 ml suspensi kuman sesuai dengan reagen Mc. Farland III 0,5, kocok sampai homgen.

c)      Ambil 1 ml dari tabung pertama dan masukkan pada tabung kedua sesuai dengan reagent Mc. Farland III 0,5, kocok sampai homogen.

d)      Ambil 1 ml dari tabung kedua, masukkan ke dalam tabung ketiga, kocok sampai homogen, sehingga diperoleh suspensi pengenceran 10x, 100x, dan 1000x (setara dengan 106 kuman per ml).

 

2.      Pembuatan Larutan Stok Antibiotika

a)      Timbang seksama 25 mg antibiotika dan larutkan dalam labu takar 25 ml dengan pelarut yang cocok sehingga diperoleh konsentrasi 1 mg/ml, saring dengan filter bakteri. Buat seri pengenceran kelipatan dua sehingga diperoleh kadar: 500 mg/ml, 125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,2

mg/ml, 15,6 mg/ml, 7,8 mg/ml, 1,95, mg/ml, 0,95 mg/ml, 0,475 mg/ml,

dan 0,237 mg/ml.

3.      Penentuan KHM

a)      Siapkan 24 tabung reaksi, isi tiap tabung dengan 0,8 ml larutan kaldu nutrisi.

b)      Tambahkan pada tiap tabung reaksi suspensi kuman (106 kuman permili) sebanyak 0,1 ml.

c)      Tambahkan 0,1 ml larutan antibiotik hasil pengenceran pada tiap tabung reaksi, lakukan secara duplo.

d)      Inkubasi di inkubator 18-24 jam 37˚C.

4.      Pembacaan Hasil

a)      Konsentrasi hambat minimal adalah konsentrasi obat terkecil yang menghambat pertumbuhan kuman.

+ : Keruh, ada pertumbuhan kuman

- : Jernih, tidak ada pertumbuhan kuman

 

 

 

4.1  Hasil

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Percobaan Uji Kadar Hambat Minimal Antibiotik

 

Jenis Antibiotika	Pengenceran 6,25 πg/ml	Pengenceran 5 πg/ml	Pengenceran 2,5 πg/ml	Pengenceran 12,5 πg/ml
Amoxicillin	Cakram: 4,5mm Silinser: -	Cakram: 7,3mm Silinser: 6,75mm	Cakram: 8,4mm Silinser: 4,3mm	Cakram: - Silinser: 8,12mm
Cefadroxil	Cakram: 8,5mm Silinser: 3,5mm	Cakram: 1,5mm Silinser: 6,75mm	Cakram: 4,5mm Silinser: 5,5mm	Cakram: 9,5mm Silinser: 8,5mm
Cefixime	Cakram: - Silinser: 10,9mm	Cakram: - Silinser: 24,5mm	Cakram: - Silinser: -	Cakram: - Silinser: -

4.2  Pembahasan

Pada praktikum uji kadar hambat minimal antibiotik ini menggunakan metode difusi. Pada metode ini zat antibakteri berdifusi pada lempeng agar yang telah diinokulasi dengan bakteri. Pengamatan dilakukan atas dasar ada atau tidaknya hambatan di sekeliling cakram dan silinder. Pada praktikumini dilakukan dengan dua cara, yaitu:

1.      Cara cakram

Cara cakram ini dilakukan dengan cara meletakkan kertas cakram yang telah dicelupkan pada larutan antibiotik yang akan diuji pada media NA (Nutrient Agar) yang telah diinokulasi bakteri, setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan dilakukan atas ada atau tidaknya hambatan di sekeliling cakram. Pada uji ini menggunakan antibiotik amoxicillin dan menggunakan 2 bakteri uji yaitu Stphylococcus Aureus dan Pseudomonas.

2.      Cara Silinder

Cara silinder ini dilakukan pada medium agar yang telah diinokulasi dengan bakteri dibuat lubang, diletakkan atau ditanamkan silinder pada media kemudian diisi dengan zat antibiotik, setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan dilakukan atas ada atau tidaknya hambatan di sekeliling kaca silinder. Pada uji ini menggunakan antibiotik amoxicillin dan menggunakan 2 bakteri uji yaitu Stphylococcus Aureus dan Pseudomonas.

Pembuatan larutan stok antibiotika dilakukan dengan cara mengitung berat antibiotik yang akan ditimbang. Dengan perhitungan sebagai berikut: